Farmácia

Biologia

Farmacotécnica

Química

Biofísica

Cromatografia em Camada Delgada e em Coluna


Cromatografia em Camada Delgada (CCD)


É um método de cromatografia plana, onde a mistura é separada pela eluição diferencial sobre uma superfície com uma camada fina de adsorvente.

É um tipo de cromatografia rápida e de baixo custo, muito útil em análise de substâncias orgânicas e organometálicas.

Os adsorventes mais utilizados para essa técnica são a sílica (SiO2), a alumina (Al2O3), a celulose, entre outros.

A sílica age como uma fase estacionária polar por reter água (vapor d'água) suficiente para agir igual a fase estacionária na cromatografia plana em papel.


A sílica tem superfície polar com ligações entre Si(+4) e O(-2) com o átomo de silício no meio e os oxigênios ao redor formando um tetraedro.
Podendo fazer ligações tanto o silício quanto o oxigênio facilmente com moléculas de água (processo de adsorção).


Os adsorventes utilizados em cromatografia de camada delgada podem ser também usados em cromatografia em coluna, normalmente com a diferença que na preparação da substância adsorvente para a camada delgada há diminuição dos grânulos e adição de aglutinante (que retém a camada à superfície -à placa de vidro-).


* Fase Estacionária:


Para preparar a fase estacionária, lava-se a placa de vidro retirando toda a gordura para não dificultar a aderência do adsorvente.

Recomenda-se passar detergente, ácido sulfônico e água.
Deve-se fazer a aplicação e espalhamento do adsorvente na placa, o que pode ser feito com a ajuda de um equipamento e também podem ser compradas placas pré-fabricadas.

Muitas vezes depois de preparadas e secas, precisam de ativação, no caso das placas de sílica e alumina coloca-se em temperaturas elevadas, entre 105 e 110 graus Celsius, por 30 a 60 minutos, sendo assim ativadas.
A celulose também deve passar pela ativação com alta temperatura por pelo menos 10 minutos.
 

O local da aplicação da amostra na placa tem que ser por volta de 1,5 a 2 centímetros da base, para evitar que as amostras sejam submersas na fase móvel.


* Fase Móvel:

Pode ser utilizado para a fase móvel um único solvente ou uma mistura deles (variando a polaridade).

A mistura é utilizada quando um único solvente não consegue separar bem os componentes da amostra, tendo que colocar um solvente na fase móvel com mais afinidade a fase estacionária para começar a eluição.

Normalmente a mistura utiliza-se três tipos de solventes, variando de polar, intermediário e apolar.
Por exemplo: fase móvel mista formada por álcool etílico, acetato de etila e tolueno.


* Revelação do Cromatograma:


Após a eluição a própria placa serve como cromatograma. 

Ela é então seca e aplicado sobre ela o revelador, normalmente borrifado, possibilitando a visualização das manchas para onde eluíram as substâncias componentes da amostra.

O revelador pode possibilitar a visualização dessas substâncias por reagir com elas formando um precipitado colorido ou por reações biológicas onde enzimas agem sobre o componente também no final deixando a substância com cor visível.


Então analisa o tamanho e intensidade da mancha comparando com o padrão, é uma análise densitométrica que pode inclusive dar dados quantitativos.




Cromatografia em Coluna


Também chamada de cromatografia de adsorção é o processo mais simples depois da cromatografia em camada delgada.


É feita em uma coluna de vidro preenchida por um fase estacionária e na ponta da coluna existe uma torneira permitindo o controle da vazão da fase móvel, como as buretas possuem.

Inclusive buretas podem ser usadas para constituir a coluna caso a quantidade de material cromatografado seja pequena.


Sendo a fase estacionária uma substância sólida a vazão por ela dependerá da polaridade, se a fase estacionária for polar terá uma atração e adsorção maior e rápida de compostos polares da fase móvel e da amostra carregados pela fase móvel.
Ficando esses compostos polares da amostra retidos por mais tempo na coluna.

Então na passagem de substâncias orgânicas, as que possuírem grupos funcionais nessa ordem indicada abaixo ficarão mais retidas:
-COOH (carboxila) > -OH (hidroxila) > -NH2 (amina) > -SH (tiois) > CHO (aldeídos) > C=O (cetonas) > -CO2R (esteres) > -OCH3 (éter) > -CH=HC- (etilenos).

Para evitar que o movimento da substância adsorvida pela coluna seja lento e que impeça a passagem formando bandas largas, no caso de alumina e sílica pode-se fazer o que chama-se de desativação delas que é feito pelo aquecimento a temperaturas acima de 700 graus Celsius ou simplesmente umedecendo a alumina da coluna com água.
Impedindo assim a ação de partes mais ativas do material e obstruir poros muito finos do adsorvente.


Nessa separação propiciada pela cromatografia em coluna forma-se cauda que é uma desvantagem, nem toda a quantidade da mesma substância fica retida no mesmo local.
E as separações não são totalmente reprodutíveis pelo adsorvente mesmo sendo do mesmo lote pode ter sua atividade variada.
Por mais que essa reprodutividade dos resultados pode ser aumentada se utilizar o tamanho de partícula adequado e igual nas duas vezes.

A acetona não pode ser utilizada como fase móvel quando a fase estacionária é alumina, pois a alumina (Al2O3) provoca a condensação (reação de junção de duas moléculas -a ligação peptídica por exemplo é uma reação de condensação entre dois aminoácidos-) de cetonas com aldeídos.


* Fase móvel:
 


Tem como principal função servir como solvente para a amostra e ajudá-la a eluir pela coluna, inclusive ao final do processo para retirar toda a amostra, sendo por isso chamado de eluente.

A fase móvel tem que ser escolhida observando critérios então, como a solubilidade e alta volatilidade tendo o ponto de ebulição baixo entre 35 e 85 graus Celsius podendo ser facilmente evaporada da coluna.

- Lista de Substância que podem ser usadas como fase móvel em ordem crescente de polaridade:
Hexano < éter de petróleo < ciclohexano < tetracloreto de carbono (CCl4) < benzeno < tolueno (ou metilbenzeno) < diclorometano (CH2Cl2) < Clorofórmio (CHCl3) < Éter elítico < acetato de etila < Piridina < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido acético.



* Fase Estacionária:


Para a preparação da coluna, ela deve ter seu enchimento feito de forma uniforme (sem deixar ar retido entre as partículas) com a fase estacionária.
Para isso mistura-se a substância da fase estacionária com a fase móvel em um frasco, formando uma pasta e depois colocá-la na coluna.

Então deixa-se o material assentar gradualmente e havendo uma uniformidade no tamanho de partícula a homogeneidade da fase estacionária será maior.

Não se deve deixar a coluna secar (evaporar completamente a fase móvel), mantendo sempre um fluxo de fase móvel durante o enchimento do tubo e eluição das amostras, pois quando seco aparecem rachaduras no material da coluna (na fase estacionária), deixando a separação cromatográfica bastante alterada.

Depois de preparada a coluna e aplicada a amostra sobre o material, coloca-se uma camada de areia para assegurar a uniformidade do escoamento e da eluição da amostra pela fase móvel.
Normalmente essa camada de areia tem entre 1 e 2 centímetros.


Então como já se sabe quanto mais fracamente um componente da amostra for adsorvido pela coluna mais rápida será sua passagem por ela.


0 comentários:

Postar um comentário