Introdução à Cromatografia

Introdução à Cromatografia

O termo cromatografia deriva das palavras gregas:

"chrom" = cor.

"graphe" = escrever.

Embora o processo não dependa de cor, exceto para facilitar a identificação.


É um processo que permite efetuar a separação, identificação e quantificação de substâncias em misturas.

Para isso passa-se a mistura carregada por uma fase móvel sobre uma fase estacionária, tendo alguns componentes que são mais arrastados pela fase móvel e alguns que são retidos à fase estacionária.
 
Resultando assim em migrações diferentes entre os componentes da mistura.


* Existem dois tipos de classificações importantes dos métodos cromatográficos.

- Cromatografia líquida e cromatografia gasosa diferenciam entre si principalmente pelo estado físico de suas fases móveis.

Na cromatografia gasosa as interações são somente da fase estacionária com a fase móvel (gás), pois a fase móvel é inerte.

Mas na cromatografia líquida a polaridade das duas fases importam na separação da mistura.

- Cromatografia em coluna e cromatografia plana tem como principal diferença o local onde sua fase estacionária está colocada, ou em um tubo cilíndrico ou sobre uma superfície plana.
(Em cromatografia plana a fase móvel é sempre líquida a fase estacionária pode ser sólida ou líquida -não existindo cromatografia plana gasosa).



* Classificação Importante:
Em cromatografias líquidas de fase normal, a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel.
Mas em cromatografias líquidas de fase reversa, a fase estacionaria é mais apolar do que a fase móvel.

Cromatografia Plana

O mais simples dos métodos cromatográficos é a cromatografia plana, entre elas a mais simples é a chamada de cromatografia em papel.

É feita com uma tira de papel que fica com parte submersa em uma cuba cromatográfica fechada hermeticamente.

A tira de papel é usada por causa da celulose possuir capilaridade e ser formada por glicoses ligadas (ligação glicosídica beta-1,4) onde suas hidroxilas podem interagir e se ligar a fase estacionária que nesse caso fica sobre o papel (fase normal (polar) é utilizada a água) retida pelas ligações que se formam e a fase móvel que é menos polar é mais repelida pela estrutura (eluindo mais).


* Preparação da fase estacionaria: No papel é aplicado normalmente 1 micrograma de amostra e depois ele é secado.

Depois aplica-se a fase estacionária aquosa sobre o papel, para isso ele é colocado sobre vapor de água, onde ele é saturado.


O papel é então colocado dentro da cuba que é fechada para não deixar vapores da fase móvel apolar saírem, essa fase móvel que é relativamente apolar irá então eluir da base submersa do papel até cerca de 10 centímetros.
Certo momento a gravidade passa a impedir mais da sua movimentação pela capilaridade.

Porém com a subida da substância apolar os componentes da amostra que interagirem com a fase móvel mais que com a fase estacionária (água) serão arrastados juntos.
Havendo separação das substâncias da amostra por afinidade, ou seja, dissolução maior em materiais polares ou apolares, podendo ser levados ou retidos neles.


Nesse caso de fase estacionária polar (normal), as substâncias mais polares ficaram retidas na base do papel, onde a amostra foi aplicada, pois não eluíram muito com a fase móvel.
As menos polares estarão mais para cima, tendo percorrido uma distância maior. 
Pois eluíram com a fase móvel (apolar).


Então o papel será o material de análise e ele muitas vezes tem que ser revelado, pois as substâncias que se separam são normalmente incolores.
  

* Revelação do papel:

Depois que a fase móvel elui, retira-se o papel da cuba e seca-o com secador de cabelo com ar quente ou frio.

Para poder enxergar manchas de substâncias incolores ele terá que passar por uma revelação que permita enxerga-las.
Para isso pode-se usar luz U.V. ou vapores de iodo.

Existem reveladores específicos para certas substâncias que podem ser borrifados sobre o papel e irão reagir formando complexos entre as substâncias que serão coloridos e evidenciando o local da mancha.

Como por exemplo revelador específico para íons de chumbo: borrifar a solução I formada por di-fenil-tiocarbazona a 0,05% em tetracloreto de carbono, logo depois borrifa-se a solução II do revelador formada por hidróxido de amônia a 25% em água.

Assim aparece (é revelada) a mancha (fica colorida) que contem íons de chumbo.


* Depois da revelação observa-se a distância que as substâncias percorreram para ter uma análise qualitativa da amostra. 

Analisa-se assim o fator de retenção (que é a distância percorrida por cada uma das substâncias que deixaram manchas no papel em locais diferentes).

Rf (fator de retenção) é encontrado pela divisão da distância percorrida pela substância com a distância total percorrida pela fase móvel.

Não dá para se criar um fator de retenção padrão para determinada substância, pois sua eluição é modificada por vários fatores como papéis diferentes e temperatura. 
Para a identificação de uma substância em especial na amostra, por exemplo, aplica-se ao lado da amostra uma amostra-padrão. 
Fazendo a eluição das duas juntas.

A amostra-padrão possuirá a substância que se quer encontrar na amostra. Então se elas apresentarem manchas iguais (com o mesmo fator de retenção e mesma cor), saberá que possuem o mesmo componente. 

Em caso de observação de substâncias desconhecidas e não presentes no padrão, pode-se eluir essa substância do papel, depois de separada, e aplicar métodos (como infravermelho, espectrometria de massa, fluorescência por raios X, etc) para tentar obter sua identificação.

Cromatograma

As medidas quantitativas e qualitativas obtidas em uma análise cromatográfica são mostradas no cromatograma que é obtido ou na superfície planar onde ocorreu a eluição (em caso de cromatografia plana) ou pelo sinal registrado pelo detector após o eluato passar pela coluna. 

Em coluna poderia também (como na cromatografia plana) observar diretamente na coluna os componentes que foram mais eluídos na fase estacionária pelo arraste da fase móvel pela coluna.
Observando a distância que percorreram e comparando assim suas polaridades.

- Se eluíram mais em uma coluna de fase estacionária polar quer dizer que eles tem afinidade maior pela fase móvel se ligando pouco à coluna.
 

- Mas se logo que entraram na coluna se ligaram a ela, quer dizer que têm pouca afinidade à fase móvel e maior afinidade com a coluna polar.
Portanto esse material que elui menos é mais polar.


Porém durante a cromatografia em coluna (como o HPLC -um tipo de cromatografia liquida em coluna de alta eficiência-) normalmente a amostra que passa pela coluna é rapidamente eluída para fora pelo fluxo contínuo de fase móvel passando que a carrega para fora da coluna.
(Não possibilitando que se observe os fatores de retenção diretamente da coluna)

No entanto as primeiras porções que saírem da coluna terão composição diferente (possuindo diferentes componentes da amostra) em comparação às posteriores porções que forem saindo pela fase móvel carregando amostra.

Pois terá partes da amostra que a afinidade à fase móvel será bem maior do que à fase estacionária e sairá primeiro sem ficar retida, como outras partes (outros componentes da amostra) ficarão retidas por mais tempo ate a fase móvel conseguir arrastá-las (por terem baixa afinidade à fase móvel e maior à fase estacionária)

Sendo assim quando essas frações que vão saindo, são coletadas em volumes idênticos e as concentrações das substâncias ali presentes são medidas pelo detector.

Processo análogo ao da cromatografia plana: Podendo cada fração a ser medida considerada como equivalente a medição da distância entre a eluição das amostras na cromatografia plana.


Cromatograma de um HPLC: 

 

Nesse cromatograma de HPLC percebe-se que o primeiro componente a sair da coluna carregado pela fase móvel é o que tem menor afinidade com a fase estacionária passando direto por ela junto com as substâncias da fase móvel.
 

 Nesse caso foi usado como fase móvel metanol e ácido acético a 1% em água o que faz essa cromatografia ser de fase reversa e mostra que os componentes mais polares foram arrastados primeiro (pela fase móvel que é polar), ficando menos retidos pela fase estacionária apolar.

Cromatografia Líquida em Coluna

A fase móvel ao passar pela coluna pode ser da maneira clássica, que o escoamento ocorre pela força da ação da gravidade.

E também pode ser a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, a sigla em português é CLAE) onde a fase móvel passa pela coluna com a fase estacionária (nesse caso não mais de vidro e sim metálica) pela ação de uma bomba de alta pressão que faz a passagem da fase móvel ser bem mais rápida.
 
Além da rapidez, essa técnica possibilita o uso de colunas finas que são bem seletivas com fases estacionárias específicas, então a separação tem elevada eficiência também.  

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica que pode ser usada tanto para análise de misturas orgânicas quanto inorgânicas.